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Conoce los nuevos sistemas de edición del genoma para obtener mejores cosechas

Caixia Gao y un miembro de su equipo inspeccionan plantas de tomate editadas con CRISPR en un invernadero en sus instalaciones de cultivo en Beijing. Crédito: Stefen Chow

Los científicos de plantas están recurriendo a técnicas de edición del genoma para adaptar con precisión la productividad y el atractivo para el consumidor en cultivos importantes. La edición de bases y edición de calidad (prime editing) se suman a las primeras técnicas de edición con CRISPR/Cas9.

Nature / 27 de abril, 2022.- ¿Hay algo mejor que una frutilla de verano perfectamente dulce? Por desgracia, muchas bayas comerciales se ven mejor de lo que saben. Pero la bióloga molecular Caixia Gao y sus colegas del Instituto de Genética y Biología del Desarrollo en Beijing han ideado una forma de ajustar la dulzura de las frutillas utilizando algunos ajustes genéticos simples [1]. “Podríamos aumentar el contenido total de azúcar de 20 a 41 miligramos por gramo”, dice. “Y hay tantos niveles diferentes que puedes elegir lo que quieras”.

Gao es uno de un número creciente de grupos de investigación que recurren a estrategias conocidas como edición de bases y la edición de calidad (prime editing) para mejorar el rendimiento, la solidez y el atractivo para el consumidor en cereales, frutas y verduras comerciales. Los métodos son adaptaciones del sistema CRISPR-Cas9 ampliamente utilizado, que se puede utilizar para introducir cambios específicos en lugares definidos en el ADN. Permiten a los científicos modificar la secuencia de aminoácidos de una proteína de interés, por ejemplo, o alterar las secuencias que controlan la fuerza con la que se expresa un gen.

Los investigadores biomédicos se han abalanzado sobre estas tecnologías como herramientas para estudiar, y potencialmente reparar, mutaciones asociadas con diversos trastornos genéticos. Las frutillas más dulces pueden parecer papas pequeñas en comparación, pero se están aprovechando las mismas capacidades para generar cultivos con mayor resistencia a las enfermedades, mayor contenido nutricional o más fruta por planta.

De manera crucial, estos sistemas de edición podrían algún día ofrecer una alternativa atractiva a la adición de genes de otras especies para generar organismos genéticamente modificados (OGMs o transgénicos), que siguen siendo objeto de escepticismo público y un estrecho escrutinio regulatorio. “Los OGMs tienen genes de otras fuentes, pero para las plantas editadas genéticamente, puedes tener estas plantas libres de cualquier gen extraño, solo algunos pequeños cambios en los propios genes de la planta”, dice Jian-Kang Zhu, director del Centro de Biología del Estrés en Plantas. Biología de Shanghái, en China. La primera ola de frutas, verduras y granos modificados con editores de bases podría llegar a los consumidores en los próximos años, pero queda mucho trabajo por hacer antes de que Zhu y otros científicos de plantas puedan producir cultivos personalizados de manera rutinaria para satisfacer las necesidades de un planeta hambriento.

Cubriendo las bases

En la edición con CRISPR, una enzima conocida como Cas9 se dirige a un sitio particular en el genoma, donde se une y corta ambas hebras del ADN. El direccionamiento se logra mediante un ARN guía, que busca una secuencia coincidente en el ADN.

Después de que Cas9 corta el ADN, la célula se mueve para reparar el daño a través de un mecanismo conocido como unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés). Este proceso de reparación a menudo da como resultado la inserción o eliminación de pares de bases aleatorios en el sitio de corte, lo que altera la función del gen objetivo. “Es eficiente, pero no preciso”, dice Yiping Qi, científico de plantas de la Universidad de Maryland en College Park. «Así que eso puede llevar fácilmente a la desactivación de genes, pero no necesariamente a muchos de los resultados que desea lograr». Esta falta de previsibilidad es un problema particular si el objetivo es optimizar la función de un gen en lugar de simplemente detenerlo en seco.

En 2016, el equipo del biólogo químico David Liu de la Universidad de Harvard en Cambridge, Massachusetts, desarrolló una solución [2]. Los investigadores fusionaron una versión modificada de Cas9 con una enzima llamada citidina desaminasa, que modifica químicamente una base de citidina de tal manera que un par de bases C-G se transforma en T-A, un proceso llamado edición de base de citosina.

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El equipo de Liu desarrolló un editor de bases de adenina para convertir los pares de bases A–T en C–G al año siguiente [3], y desde entonces se han ideado docenas de otros editores de bases de citosina y adenina. Esta tecnología se ha traducido notablemente bien de células de mamíferos a células de plantas, y solo se requieren modificaciones modestas para optimizar la eficiencia y la especificidad de las técnicas. La eficiencia varía enormemente según el gen objetivo y la especie de la planta, pero puede alcanzar hasta el 100%.

En 2019, investigadores en Francia utilizaron un editor de base de citosina para crear un cambio de un solo nucleótido en un gen llamado eIF4E1, que codifica una proteína que ayuda a traducir el ARN en proteínas [4]. «Esa proteína también es utilizada por algunos virus para sus propios ciclos de replicación», dice Fabien Nogué, genetista de plantas del Instituto Nacional de Investigación para la Agricultura, la Alimentación y el Medio Ambiente (INRAE) de Francia en Versalles, que participó en el trabajo. Una sola edición fue suficiente para hacer que Arabidopsis thaliana fuera esencialmente inmune al virus de la vena amarilla del trébol, un patógeno vegetal común.

Ese mismo año, el equipo de Gao utilizó la edición de base para introducir mutaciones puntuales en dos sitios del genoma del trigo para conferir resistencia a una variedad de herbicidas [5].

Los investigadores pueden incluso realizar experimentos de «evolución dirigida», con mutaciones aleatorias introducidas en varios genes para identificar nuevas variantes que mejoren un rasgo particular de la planta. En 2020, por ejemplo, Gao y sus colegas utilizaron un sistema combinado de edición de bases de citosina y adenina para diseñar variantes de un gen de arroz que confería resistencia a una clase de herbicidas conocidos como inhibidores de acetil-CoA carboxilasa [6]. “El dominio objetivo era de 400 aminoácidos y diseñamos 200 ARN guía que cubren completamente este dominio”, dice Gao. “Luego examinamos a los mutantes rociándolos con herbicida para ver qué nuevas variantes sobreviven”. El esfuerzo reveló mutaciones que confieren resistencia sin afectar negativamente la salud de la planta.

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Una oportunidad de calidad

A pesar de su poder, la edición de bases tiene un potencial limitado. Solo 4 de los 12 posibles cambios de pares de bases se pueden lograr de manera confiable. Los investigadores han desarrollado algunos editores de bases de citosina a guanina, pero una evaluación realizada el año pasado por el equipo de Qi encontró que estos son generalmente inadecuados [7]. Qi los describe como «no eficientes» y dice que «todavía hay una brecha de conocimiento sobre cómo mejorarlo».

La edición de base tampoco es adecuada para realizar cambios extensos en un gen, como inserciones o eliminaciones largas. Este tipo de modificación se puede lograr con CRISPR-Cas9 convencional mediante la explotación de un proceso conocido como reparación dirigida por homología. Aquí, la célula incorpora una hebra de ADN donante que contiene el cambio de secuencia deseado en el sitio de corte Cas9. Pero el proceso sigue siendo ineficiente en las plantas. “Tal vez, en el mejor de los casos posibles, podría obtener eficiencias del 5 %”, dice Holger Puchta, bioquímico de plantas del Instituto de Tecnología de Karlsruhe en Alemania.

El trigo editado con CRISPR se trasplanta a un invernadero en una instalación de cultivo en Beijing. Crédito: Stefen Chow

Como alternativa, en 2019, el grupo Liu describió otra estrategia basada en CRISPR, conocida como edición principal [8]. Al igual que la edición de bases, la edición de calidad usa una proteína Cas9 modificada que hace un corte monocatenario. Pero esta vez, el Cas9 está acoplado a una enzima transcriptasa inversa, en lugar de a una modificadora de nucleótidos. La edición principal también utiliza un ARN guía de edición de calidad especialmente diseñado (pegRNA), que no solo dirige la maquinaria de edición a un sitio específico en el genoma, sino que también contiene una secuencia de plantilla y una secuencia de unión de cebadores. La plantilla codifica el cambio de secuencia del genoma deseado. Y después de que se corta el ADN, la secuencia de unión al cebador se hibrida con el ADN en el sitio de corte, proporcionando un punto de apoyo para que la transcriptasa inversa convierta la plantilla de ARN en ADN y, por lo tanto, escriba la secuencia codificada en el genoma. Este proceso puede cambiar cualquier nucleótido, así como insertar o eliminar secuencias de decenas de bases.

La versatilidad resultante abre la puerta a ediciones sofisticadas y potentes. Las ediciones de una sola base no pueden hacer mucho para evitar los patógenos de las plantas, señala Nogué. “Cuanto más simple sea su modificación, más fácil será para el virus escapar”, dice. Su equipo, junto con colaboradores del INRAE ​​en Aviñón, examinó los determinantes naturales de la resistencia a los potyvirus, que pueden dañar gravemente las plantas, e identificó un conjunto de cinco variantes de aminoácidos en el gen eIF4E1 que protegen colectivamente a las plantas de guisantes contra la infección [4]. Nogué ahora está utilizando la edición de calidad para transferir esta protección a las papas. “Con múltiples cambios de aminoácidos, creemos que traeremos una resistencia duradera”, dice.

El editor de calidad original era relativamente ineficiente, generalmente del orden de lo que se puede lograr con la reparación dirigida por homología. Pero algunas secuencias genómicas parecen ser más manejables que otras, y un experimento de edición principal bien diseñado puede tener el doble de eficiencia [9]. «Creo que todavía hay espacio para mejorar», dice Gao, cuyo equipo ya ha ideado múltiples estrategias para mejorar el rendimiento de la edición de calidad, incluidos diseños sofisticados de pegRNA y variantes del complejo de edición basado en Cas9 que tienen funciones mejoradas.

Por su parte, Nogué y su grupo han tenido éxito con la edición de calidad en especies de plantas modelo bien caracterizadas. Ciertas mejoras “hacen que la tecnología sea tan eficiente como la edición de bases en nuestras manos”, dice. “Si lo que observamos en las plantas modelo es cierto para los cultivos, creo que esta herramienta será muy, muy útil”.

Cosechando lo que siembras

La aplicación de edición de base o de calidad es razonablemente sencilla para algunos cultivos bien estudiados. El grupo de Zhu ha trabajado extensamente con ambas técnicas en el arroz, y otros cultivos importantes como el trigo, el maíz, los tomates y las papas también han demostrado ser aptos para la edición. Qi señala que hay disponibles varias herramientas basadas en la web para ayudar a los investigadores a elegir el sistema de edición adecuado para ellos, incluida PlantPegDesigner, una aplicación diseñada por el grupo de Gao [10].

Pero partes importantes del proceso siguen siendo una lucha. El primero es la transformación, el proceso mediante el cual los investigadores introducen la maquinaria de edición en las células vegetales. Una de las estrategias de transformación más comunes utiliza la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens para infectar y luego entregar plásmidos de ADN que codifican la proteína Cas9 y los ARN asociados en las células vegetales. Sin embargo, este ADN posteriormente también se integra en el genoma de la planta, un resultado indeseable dado el enfoque del campo en evitar la introducción permanente de ADN extraño. También existe el riesgo de modificaciones no deseadas derivadas de la expresión a largo plazo de la maquinaria de edición del genoma.

Los investigadores pueden lograr una transformación libre de ADN extraño mediante la entrega de los materiales necesarios para la edición en protoplastos, células vegetales cultivadas a las que se les ha quitado enzimáticamente su pared celular externa. Estas células son mucho más fáciles de transformar transitoriamente para los investigadores, ya sea con reactivos de ADN o ARN que codifican la maquinaria de edición. “Estás haciendo células con solo una membrana celular, como una célula humana”, dice Qi, quien señala que este proceso también ofrece un método sólido para probar y optimizar rápidamente los experimentos de edición de bases o de edición de calidad. Otra posibilidad es usar una ‘pistola de genes’ para disparar pequeños proyectiles cargados de proteína y ARN en células vegetales embrionarias. En ambos escenarios, la maquinaria de edición estará activa en la célula solo temporalmente, antes de degradarse, en contraste con la expresión a largo plazo que ocurre cuando el ADN se integra en el genoma del huésped.

Cualquiera que sea el método de transformación, los investigadores deben usar las células editadas para regenerar una planta completa. Pero para muchas especies de plantas, los biólogos simplemente no tienen el conocimiento o la experiencia para aislar, cultivar y transformar transitoriamente las células apropiadas. “En la naturaleza, hay más de 370 000 especies de plantas superiores”, dice Zhu. “Pero solo podemos hacer que la transformación sea exitosa en unas pocas docenas de estos”. Algunas soluciones tecnológicas emergentes podrían ayudar; por ejemplo, la sobreexpresión de genes que codifican factores reguladores del crecimiento puede mejorar en gran medida la eficiencia de la regeneración de plantas editadas genéticamente [11]. «Bien podría ser que veamos muchas más plantas que son muy difíciles de transformar siendo transformadas y editadas debido a esto», dice Puchta.

Los investigadores también se ven obstaculizados por una falta fundamental de comprensión sobre la biología subyacente de muchos rasgos clave relacionados con el crecimiento, la resiliencia y la calidad de las plantas. “Sin el conocimiento de los genomas y un conocimiento muy profundo del mecanismo que está detrás de un determinado rasgo, este tipo de herramientas son completamente inútiles”, dice Nogué.

El costo decreciente y la eficiencia cada vez mayor de las tecnologías de análisis genómico deberían ser una bendición aquí, y se están realizando esfuerzos para comenzar a aplicar algunas de las técnicas que se usan de manera rutinaria en la genética clínica en los sectores agrícolas. Por ejemplo, Pairwise, una empresa de biotecnología con sede en Durham, Carolina del Norte, EE.UU., que fue cofundada por Liu y obtuvo la licencia de su tecnología de edición de bases, está colaborando con científicos académicos y del gobierno en los Estados Unidos y Canadá para identificar las bases genéticas de más de 50 rasgos en al menos 300 especies y variedades únicas de bayas, dice el director de tecnología Ryan Rapp. “Pasamos de no tener casi nada a más de 600 genomas secuenciados a través de esta colaboración”.

Evolucionando más allá de los transgénicos

Sin embargo, incluso con las herramientas que tienen actualmente, el campo se está moviendo rápidamente. Rapp dice que se espera que el primer producto editado de bases de Pairwise, una verdura de hojas verdes con un contenido mejorado de nutrientes, llegue al mercado estadounidense el próximo año. Otro proyecto de Pairwise, una cereza sin cuesco, está ahora en pruebas de campo, pero llevará más tiempo llegar al mercado simplemente porque los cerezos tardan más en cultivarse que los cultivos en hileras.

Dichos productos, junto con proyectos similares como las frutillas más dulces de Gao, podrían ser justo lo que se necesita para ayudar a generar confianza con el público y con las agencias reguladoras por igual. Algunos reguladores, incluido el Departamento de Agricultura de EE. UU. y el Ministerio de Agricultura de China, han otorgado más libertad a las plantas editadas con CRISPR que a los OGMs (o transgénicos), siempre que los organismos o productos finales no incorporen ADN extraño de otra especie. Otras jurisdicciones son más reacias. Pero a menos que se convenza al público, la tecnología podría estar muerta en el agua. “Creo que toda la comunidad ha visto que si quieres que la gente acepte cultivos o alimentos editados genéticamente, es mejor que lo hagas más atractivo para el público”, dice Qi.

El éxito podría abrir la puerta a algunas aplicaciones verdaderamente transformadoras, incluida la agricultura mundial a prueba de futuro contra los impactos del cambio climático. Puchta señala que los intentos de reforzar la resistencia a la sequía o la tolerancia a la salinidad mediante el trasplante de genes individuales han tenido avances limitados. Pero él ve un potencial considerable en moverse en la otra dirección: domesticar cultivos silvestres resistentes modificando su comestibilidad y rendimiento agronómico.

Gao ya ha demostrado que la idea puede funcionar. En 2018, su equipo y sus colaboradores utilizaron CRISPR-Cas9 convencional para domesticar un tomate silvestre de América del Sur mediante la manipulación de cinco genes vinculados a rasgos como el tamaño de la fruta, el rendimiento y el contenido de nutrientes [12]. “A través de la domesticación natural, este proceso lleva 8.000 años de principio a fin”, dice ella. “Ahora es un año y medio”.

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